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技術文章

mRNA生物制品質量控制家族成員全新亮相

更新時間：2023-10-08 瀏覽次數：4325

mRNA藥物是通過將編碼抗原蛋白的mRNA接種到人體，利用人體細胞內的遺傳物質進行表達合成抗原蛋白，通過抗原蛋白誘導和激活機體的免疫系統產生免疫反應，從而達到預防和治療疾病的目的。

由于其具有較低的感染和突變風險，能夠同時誘導產生體液免疫和細胞免疫，免疫效能好，研發和生產周期短，容易實現量產等特點，目前被廣泛用于傳染性疾病、腫瘤及罕見病藥物的研發。

通過酶促體外轉錄法制備大量mRNA的工藝已經成熟，其中規?；a過程中主要涉及的工具酶有T7 RNA Polymerase、DNase Ⅰ、RNase Inhibitor、無機焦磷酸酶等，這些酶的靈活使用極大的方便了生產流程，加速科學家們研究進展。

mRNA規模化生產中的工具酶

T7 RNA Polymerase

T7 RNA聚合酶是由T7噬菌體DNA編碼的，一種DNA依賴性的RNA聚合酶，具有高度啟動子專一性，可催化以T7啟動子序列為起點 5’→ 3’方向的RNA合成，在mRNA藥物研發中常以其催化目的基因的體外合成，轉錄效率和產量高，市面上由其催化的1μg DNA模板可轉錄出150-200μg的RNA。

DNase I

脫氧核糖核酸酶I，是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內切酶，可以用于各種RNA樣品的處理，消化由T7 RNA聚合酶催化的體外轉錄后的DNA模板，65℃加熱10分鐘可使DNaseI失活。

RNase Inhibitor

RNase（Ribonuclease，核糖核酸酶）是一類能夠催化RNA降解為小分子RNA的核酸酶，廣泛存在于真核、原核生物的所有細胞和組織中，通常有強活性，RNA樣本中微量的RNase污染足以導致其降解。為了減少RNA的損失，適當添加RNase抑制劑（RNase inhibitor）是有必要的。

RNase抑制劑是人的胎盤中存在的一種特異性核糖核酸酶(RNase)抑制劑，能夠特異地與RNase以非共價鍵結合形成復合體從而使RNase失活。

無機焦磷酸酶

多種代謝反應會產生無機焦磷酸，Pyrophosphatas無機焦磷酸酶（PPase）可水解無機焦磷酸鹽，可以避免無機焦磷酸對反應的抑制，并且提供熱力學動力促使反應向正向進行，從而常用于RNA體外轉錄、DNA復制和擴增如HDA或LAMP等溫擴增等。

尤其在工業化生產mRNA疫苗的時候會產生大量的無機焦磷酸鹽，為了保證mRNA疫苗高效生產，可以添加無機焦磷酸酶，解除生成的無機焦磷酸鹽對反應體系的抑制。

dsRNA

添加相關工具酶還會帶來其他影響，例如使用 T7 RNA 聚合酶合成RNA的技術目前已經很成熟，但之前的研究已經確定了體外合成過程中某些副產物的存在，這些副產物會觸發細胞免疫反應，包括雙鏈 RNA (dsRNA)，這已被證明成為免疫通路的主要觸發。

檢測mRNA生物制品中殘留的必要

大多數工具酶的使用能幫助我們獲得大量的RNA，但工具酶本身對于藥物成品來說亦是一種雜質，這些雜質與mRNA一起通過LNP包封進入細胞釋放后，極有可能產生高強度的免疫原性從而連帶引發mRNA的降解。以及產生的雙鏈RNA (dsRNA)雜質具有潛在的免疫原性，對患者有害。因此，mRNA相關制品需要測定和控制工具酶和dsRNA的含量。

相關法規要求與檢測方法

——mRNA類的質量標準可以納入外觀、pH值、含量、鑒別、序列分析、mRNA完整性、加帽率、poly（ A）長度及分布、生物學活性、無菌檢測、細菌內毒素、雙鏈 RNA殘留、溶劑殘留等檢測項目。

體外基因修飾系統藥學研究與評價技術知道原則（試行）

--2022年05月

——mRNA等通過體外轉錄方式制備的核酸產品，可通過對原材料、轉錄模板和轉錄條件的研究，控制轉錄產物的質量。轉錄用的重要原材料，如核苷酸、修飾核苷酸、 5’-帽或類似物、工具酶（如轉錄酶等）等應進行適當的質量控制，可關注其純度和雜質，轉錄酶還需關注其保真度等。

轉錄模板的制備應能確保模板的序列準確性和純度，減少雜質殘留。體外轉錄條件應經過充分的研究，提高轉錄序列的準確性、均一性和完整性，減少副反應產物，如不完整 RNA、雙鏈RNA、截短RNA、長鏈RNA等的形成。

體內基因修飾系統藥學研究與評價技術指導原則（試行）

--2022年05月

CDE發布的指導原則《病毒預防用mRNA疫苗藥學研究技術指導原則（試行）》以及美國藥典（USP）發布的《mRNA疫苗質量分析方法》的指南草案中（見下圖）指出:需要對整個工藝進行質量控制，保證質量有效、安全可控。

其指導原則中還規定，需要對其生產工藝相關雜質進行檢測，對主要雜質進行監測與分析，需要更強大的評估方法來確保最終產品的質量和安全。其中對T7 RNA和dsRNA的殘留進行了明確規定。

疫苗行業

美國藥典(USP)發布的《mRNA疫苗質量分析方法》指南草案

由于mRNA技術的應用相對較新，在藥物研發和制造過程中指導mRNA質量研究與控制方面的監管指南和行業標準仍在不斷發展。

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