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如何大規模培養動物細胞（上）

更新時間：2021-09-18 瀏覽次數：3469

近年來，我國的生物技術飛速發展，細胞培養已經形成規模化，產業化生產，大規模細胞培養可分為分批式、流加式、半連續式、連續式和灌注式、細胞工廠5種技術形式。

分批式培養

分批式培養是細胞規模培養發展進程中較早采用的方式，也是其他操作方式的基礎。該方式采用機械攪拌式生物反應器，將細胞擴大培養后，一次性轉入生物反應器內進行培養。

在培養過程中其體積不變，不添加其他成分，待細胞增長和產物形成積累到適當的時間，一次性收獲細胞、產物和培養基的操作方式。

分批式培養操作簡單，培養周期短，染菌和細胞突變的風險小。反應器系統屬于封閉式，培養過程中與外部環境沒有物料交換，除了控制溫度、pH值和通氣外，不進行其他任何控制。

因培養期間細胞生長代謝是在一個相對固定的營養環境，不添加任何營養成分，直觀反映細胞生長代謝的過程，是動物細胞工藝基礎條件或小試研究常用的手段。

由于培養過程工藝簡單，對設備和控制的要求較低，設備的通用性強，反應器參數的放大原理和過程控制，比較其他培養系統較易理解和掌握，在工業化生產中分批式培養操作是傳統的、常用的方法，其工業反應器規模可達12000L。

細胞生長分為五個階段

延滯期、對數生長期、減速期、平穩期和衰退期。

分批培養的周期時間多在3-5d，細胞生長動力學表現為細胞先經歷對數生長期（48-72h)細胞密度達到最高值后，由于營養物質耗竭或代謝毒副產物的累積，細胞生長進入衰退期進而死亡，表現出典型的生長周期。

收獲產物通常是在細胞快要死亡前或已經死亡后進行。

圖 01

BioCore QC臺式細胞生物反應器

流加式培養

流加式培養是在分批式培養的基礎上，采用機械攪拌式生物反應器系統，懸浮培養細胞或以懸浮微載體培養貼壁細胞。

細胞初始接種的培養基體積一般為終體積的1/2-1/3，在培養過程中根據細胞對營養物質的不斷消耗和需求，流加濃縮的營養物或培養基，從而使細胞持續生長至較高的密度，目標產品達到較高的水平。

整個培養過程沒有流出或回收，通常在細胞進入衰亡期或衰亡期后進行終止，回收整個反應體系，分離細胞和細胞碎片，濃縮、純化目標蛋白。

流加培養根據細胞生長速率、營養物消耗和代謝產物抑制情況，濃縮的營養培養基的流加速率與消耗的速率相同，按底物濃度控制相應的流加過程，保證合理的培養環境與較低的代謝產物抑制水平。

培養過程以低稀釋率流加，細胞在培養系統中停留時間較長，總細胞密度較高，產物濃度較高。流加培養過程須掌握細胞生長動力學，能量代謝動力學，研究細胞環境變化時的瞬間行為。

流加培養細胞培養基的設計和培養條件與環境優化，是整個培養工藝中的主要內容。在工業化生產，懸浮流加培養工藝參數的放大原理和過程控制，比較其他培養系統較易理解和掌握，可采用工藝參數的直接放大。

流加培養是當前動物細胞培養中占有主流優勢的培養工藝，也是近年來動物細胞大規模培養研究的熱點。流加培養中的關鍵技術是基礎培養基和流加濃縮的營養培養基。

通常進行流加的時間多在指數生長后期，細胞在進入衰退期之前，添加高濃度的營養物質。可以添加1次，也可添加多次，直至細胞密度不再提高。

流加工藝中的營養成分

? 葡萄糖

葡萄糖是細胞的供能物質和主要的碳源物質，然而當其濃度較高時會產生大量的代謝產物乳酸，因而需要進行其濃度控制，以足夠維持細胞生長而不至于產生大量的副產物的濃度為佳。

?谷氨酰胺

谷氨酰胺是細胞的供能物質和主要的氮源物質，然而當其濃度較高時會產生大量的代謝產物氨，因而也需要進行其濃度控制，以足夠維持細胞生長而不至于產生大量的副產物的濃度為佳；

大規模培養中細胞凋亡主要由于營養物質的耗竭或代謝產物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發生，補加谷氨酰胺已不能逆轉凋亡。

另外，動物細胞在無血清、無蛋白培養基中進行培養時，細胞變得更為脆弱，更容易發生凋亡。

?氨基酸、維生素及其他

主要包括營養必需氨基酸、營養非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸；此外還包括其他營養成分如膽堿、生長刺激因子。

添加的氨基酸形式多為左旋氨基酸，因而多以鹽或前體的形式替代單分子氨基酸，或者添加四肽或短肽的形式。在進行添加時，不溶性氨基酸如胱氨酸、酪氨酸和色氨酸只在中性pH值部分溶解，可采用泥漿的形式進行脈沖式添加；

其他的可溶性氨基酸以溶液的形式用蠕動泵進行緩慢連續流加。

圖 02

懸浮細胞生物反應器

半連續式培養

半連續式培養又稱為重復分批式培養或換液培養。采用機械攪拌式生物反應器系統，懸浮培養形式。在細胞增長和產物形成過程中，每間隔一段時間，從中取出部分培養物，再用新的培養液補足到原有體積，使反應器內的總體積不變。

這種類型的操作是將細胞接種一定體積的培養基，讓其生長至一定的密度，在細胞生長至最大密度之前，用新鮮的培養基稀釋培養物，每次稀釋反應器培養體積的1/2-3/4，以維持細胞的指數生長狀態，隨著稀釋率的增加培養體積逐步增加。

或者在細胞增長和產物形成過程中，每隔一定時間，定期取出部分培養物，或是條件培養基，或是連同細胞、載體一起取出，然后補加細胞或載體，或是新鮮的培養基繼續進行培養的一種操作模式。

剩余的培養物可作為種子，繼續培養，從而可維持反復培養，而無需反應器的清洗、消毒等一系列復雜的操作。在半連續式操作中由于細胞適應了生物反應器的培養環境和相當高的接種量，經過幾次的稀釋、換液培養過程，細胞密度常常會提高。

半連續式特點是：培養物的體積逐步增加，可進行多次收獲，細胞可持續指數生長，并可保持產物和細胞在一較高的濃度水平，培養過程可延續到很長時間。

該操作方式的優點是操作簡便，生產效率高，可長時期進行生產，反復收獲產品，可使細胞密度和產品產量一直保持在較高的水平。在動物細胞培養和藥品生產中被廣泛應用。

圖 03

BioCore QF Pro不銹鋼微生物發酵系統

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